Живые часы - Ритчи Уорд

Рис. 44. Одноклеточная водоросль Gonyaulax polyedra, увеличенная приблизительно в 1000 раз.

Изучить ритмичность одиночной клетки — вот самый прямой путь для решения поставленной ею задачи. Подходящим объектом для этой цели оказалась одноклеточная морская водоросль Gonyaulax polyedra, относящаяся к классу динофлагеллят. Свечение тропических морей в первую очередь обусловлено водорослями Gonyaulax. Они имеют в диаметре около 0,05 миллиметра, то есть едва различимы невооруженным глазом.

Это одноклеточное растение оказалось очень интересным для исследования ритмичности поведения, поскольку оно обнаруживает несколько проявлений ритмической активности: ритм люминесценции, ритм клеточного деления и суточный ритм фотосинтеза. Таким образом, требование, предъявляемое Суини к объекту исследований, оказалось выполненным: у живых часов Gonyaulax ясно видимых «стрелок» было предостаточно.

Налицо была и зависимость работы часов от хорошо изученных биохимических реакций. Люминесценция таких организмов, как Gonyaulax, обусловлена ферментативными реакциями, поскольку испускающая свет система состоит из самого фермента (люцифсразы) и субстрата, или вещества, с которым реагирует фермент (люцифе-рина). (Несмотря на очень большой объем литературы по биолюминесценции, истинная природа люциферина и люциферазы в клетках Gonyaulax еще не выявлена.)

Итак, для исследования ритмичности Суини выбрала Gonyaulax.

Рис. 45. Рисунок, выполненный по электронно-микроскопической фотографии среза клетки Gonyaulax.

Давно известно, что в условиях непрерывного освещения ярким светом многие биологические ритмы постепенно исчезают. Бюннинг показал это на примере суточного движения листьев еще в 1931 году. Листья растения фасоли, привыкшего к нормальному чередованию дня и ночи, просто переставали двигаться, когда его переводили в условия непрерывного яркого освещения. Тщательные лабораторные наблюдения над многими ритмами других организмов дали те же результаты. То же самое показала и культура Gonyaulax: если суспензию клеток долго освещать ярким светом, все ритмы исчезают, хотя растения продолжают размножаться.

Чем же определяется такое поведение? Значит ли это, что каждая из клеток в популяции теряет свой ритм, или нарушается синхронность между клетками, все еще сохраняющими ритмичность функционирования? Быть может, индивидуальные ритмы расходятся по фазе настолько сильно, что начинают гасить друг друга?

Рис. 46. Игрушка «ныряльщик».

Чтобы ответить на этот вопрос, нужно было выяснить, сохраняет ли ритм отдельная клетка в условиях непрерывного яркого освещения. Но какой ритм вообще сохраняется в подобных условиях? Люминесценцию яркий свет подавляет. Нарушается и ритм клеточного деления: клетки, выращенные на ярком свету, делятся не через строго определенные интервалы времени. Единственная возможность обнаружить на ярком свету ритм у одиночной клетки — это изучить ее фотосинтез. Более ранними экспериментами было показано, что суспензия клеток Gonyaulax в условиях чередования света и темноты обнаруживает четкий суточный ритм фотосинтеза. За его изменением можно следить, измеряя объем кислорода, выделяемого культурой в течение дня. Сделать это непросто, поскольку количество кислорода, выделяемое даже тысячами клеток Gonyaulax, чрезвычайно мало. Измерить его можно только с помощью очень точных приборов. Микрореспирометр соответствующей чувствительности был разработан Сколендером с сотрудниками. В нем используется поплавковый респирометр, в котором объем пузырька газа поддерживается постоянным.

Чтобы понять принцип действия такого респирометра, вспомним игрушку «ныряльщик». Она была придумана Рене Декартом в XVII веке и основана на том принципе, что каждый плавающий предмет вытесняет количество воды, равное его весу. Ныряльщик представляет собой стеклянную трубочку с небольшим пузырьком газа у запаянного конца. Трубочка ровно настолько заполнена водой, чтобы ныряльщик мог свободно плавать в сосуде с водой. Отверстие сосуда затянуто резиновой пленкой. Когда палец касается пленки, воздух в пузырьке сжимается, внутрь ныряльщика попадает несколько большее количество воды и он тонет. Если палец убрать, воздух снова расширяется и ныряльщик всплывает.

С помощью изящного усовершенствования Суини приспособила поплавковый респирометр для измерения объема кислорода, выделяемого одной-единственной клеткой Gonyaulax.

Вместо стеклянного ныряльщика Суини использовала тончайший капилляр, сделанный из пластика. Один конец капилляра запаивался, другой оставался открытым; в просвете капилляра сохранялось некоторое количество воздуха. При нормальном давлении пластиковый поплавок лежал на дне пробирки с культуральной жидкостью.

Рис. 47. Поплавковый респирометр для измерения выделения кислорода одиночной клеткой Gonyaulax. Вверху слева — полная схема аппарата, показывающая регулировку давления, измерительную систему, бинокулярный микроскоп, направленный на трубку, содержащую поплавок и одиночную клетку Вверху справа — тонкая стеклянная трубка (диаметром 0,1 мм) с культуральной средой, поплавком и одиночной клеткой (при большом увеличении). Внизу — заключенный в капилляре воздух при снижении давления расширяется и, образуя пузырек, поднимает поплавок.

Если давление над раствором понижалось, воздух, находящийся в капилляре, расширялся, образуя на конце поплавка крошечный пузырек. При дальнейшем снижении давления размер пузырька увеличивался и поплавок медленно всплывал. Регулируя давление газа над поверхностью культуральной жидкости, можно удерживать поплавок на определенной высоте.

Теперь уже определить объем кислорода, выделяемого одиночной клеткой, не представляло особого труда. В небольшую пробирку вместе с поплавком помещалась одна клетка Gonyaulax. Выделяемый клеткой кислород увеличивал давление над раствором, сжимал пузырек воздуха, выступающий из поплавка, и поплавок тонул. Снижая давление с помощью дополнительной регулирующей системы, Суини могла компенсировать увеличение давления кислорода и удерживать поплавок на исходной высоте. Таким образом, по изменению давления, которое определялось ртутным манометром, Суини измеряла количество кислорода, выделенного клеткой Gonyaulax.

О сложности этого эксперимента говорит следующее. Суини, регулируя давление в сосуде, должна была удерживать поплавок точно на уровне линии, отмеченной в окуляре микроскопа, через который она вела свои наблюдения. А поскольку при изменении температуры все газы либо расширяются, либо сжимаются, пробирка с клеткой и поплавком помещалась в сосуд с водой, температура которой поддерживалась на постоянном уровне (с точностью до 0,03 °C).

Располагая микрореспирометром и отработав методику, Суини уже могла приступить к изучению интересующего ее вопроса — сохраняют ли одиночные клетки те же ритмы, которые свойственны популяции в целом.

С этой целью клетки Gonyaulax выращивались в условиях чередования 12 часов света и 12 часов темноты. Суини предполагала, что фотосинтетическая активность одиночной клетки будет увеличиваться сразу после рассвета, доходить до некоторого максимума к полудню и снижаться по мере наступления сумерек. Эксперименты полностью подтвердили ее предположения. Но в ходе экспериментов исследовательница столкнулась с неожиданным осложнением — ни в одной из клеток фотосинтез не продолжался более 14 часов. Суини пыталась продлить жизнь клетки, добавляя антибиотики, но это не помогло.

И чтобы охватить измерениями весь 24-часовой период, Суини начинала опыты в разное время суток: на рассвете, через час после рассвета, через два часа после рассвета и так далее, всякий раз наблюдая за клеткой на протяжении 14 часов.

Данные фотосинтетической активности отдельных клеток, полученные в последовательных экспериментах, откладывались на графике, и выводилась суммарная кривая. Она отражала типичный суточный ритм фотосинтетической активности одиночной клетки Gonyaulax, в существовании которого Суини не сомневалась. На рассвете клетка выделяла около двух миллионных долей миллилитра кислорода в час. Через 5 часов это количество увеличивалось почти вдвое, через 14 часов оно снижалось опять до исходного. После достижения этого минимального уровня оно вновь начинало подниматься. Таким образом, эксперимент подтвердил правильную суточную периодичность фотосинтеза у одиночных клеток Gonyaulax.

Теперь можно было переходить к основному эксперименту. Суини вырастила при постоянном ярком освещении новую культуру клеток. И, поместив одиночные клетки из этой культуры в респирометр, вернулась к своим наблюдениям за уровнем поплавка.